无菌检查薄膜过滤器（无菌检查法中薄膜过滤法的滤膜孔径应不大于 μm）

中国药典无菌检查法的供试品的无菌检查

检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。

（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“抽验数量 系指一次试验所用供试品最小包装容器的数量（支或瓶），成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外，原液、半成品和成品按表1规定，上市产品监督检验按表2规定。 ”） 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“接种量 系指每个最小包装的最少取样量（ml或g），接种供试品量按表3规定。若采用直接接种法，按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中(两种培养基的接种支（瓶）数之比为2:1);若采用薄膜过滤法，应采用三联薄膜过滤器，其中两联假如硫乙醇酸盐流体培养基，一联加入改良马丁培养基。只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。”） 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。

（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法，加菌量小于100cfu。阳性对照也可在供试品无菌检查14天后，取其中一份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100cfu阳性对照菌，作为阳性对照。阳性对照置30℃～35℃培养48～72小时应生长良好。”） 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。

操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。

无菌检查法的抑细菌和抑真菌试验

在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作

用。用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭

菌、白色念珠菌均10～100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定

的温度，培养3～5天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。

如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不

生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和

法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。

检查法

无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品，后

者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。

操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌

的方法取内容物。

凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。

1. 直接接种法

(1) 供试品准备 供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶

液，按表1或表2规定量取供试品，混合。

供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料。

按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9%无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的

溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。

供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪

取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11

股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以

浸没供试品的适量培养基中。或用0.9%无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、

输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。

供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭

活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。亦可按薄膜过滤法检查。

供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。每

管接种量为0.2ml。

2.操作 取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌

培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培

养基5管。轻轻摇动,使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真

菌培养基管置20～25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照

管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外

观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上

继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用

接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。 2. 薄膜过滤法

如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下规定的方法处理

后, 加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中, 混合后，通过装有孔径

不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜

至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基

分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培

养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(

抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真

菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养

24～72小时有菌生长。

结果判断

当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结

果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,

均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有

菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有

菌生长，否则应判为供试品不合格。

无菌检查薄膜过滤器需要用0.22um滤膜吗

1、灭菌方法

培养基的灭菌方法主要有两种，高压除菌及0.22um微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比，高压灭菌的工作强度小，成本较低，但易造成营养成分的流失，而且在多次加样（无菌谷氨酰胺溶液，无菌碳酸氢钠溶液等）过程中容易造成二次污染。大多数培养基采用0.1～0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌，并且已成为培养基除菌的发展方向，它可低限度地减少培养基的营养损失。

1.1 高压灭菌

某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，例如清大天一的MEM培养基中的MD605、MD609等。这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的无菌的液体。另外可高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。

可高压灭菌的培养基在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证很关键。

1.2 过滤灭菌

可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。一般情况下采取正压过滤，正压过滤较之负压过滤具有流速高、过滤快、不易污染，可避免蛋白质产生大量气泡等优点。一般使用过滤器可参照各供应商的产品说明书。

目前大多数实验室和制采用微孔滤膜滤器（如Zeiss滤器）或立式微孔滤器（Millipore、Pall）除菌。微孔滤膜滤器为不锈钢，中间可夹放0.22um滤膜。使用这种滤器最重要步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。如在使用Zeiss滤器时，先要用培养用水将滤膜充分润湿，在安装滤膜时可在其上放置一层定性滤纸再固定。消毒时旋钮不要扭太紧，凡与空气接触部位都要包好（可用牛皮纸、纱布、无纺布等）；高压灭菌后，在无菌环境中立即将旋钮扭紧。过滤除菌结束后，要打开滤器，检查滤膜是否完整，如果滤膜破裂，需重新进行过滤除菌过程。立式微孔滤器可以选用不同的微孔滤柱体积，因为滤膜的折叠，膜面积显著增大，液体处理量大，而且不容易发生堵塞现象。

纯化水检测需要哪些仪器.设备

基本都是颜色反应不需要太多的仪器设备，硝酸盐、不挥发物、重金属检查：水浴锅；微生物限度检查：洁净操作台、薄膜过滤器（抽滤泵）、恒温培养箱2个。净得瑞纯化水设备系统采用RO及EDI纯化水工艺，产水水质满足客户的生产用水要求，符合GMP、FDA等认证要求。

水浴锅主要用于实验室中蒸馏，干燥，浓缩，及温渍化学药品或生物制品，也可用于恒温加热和其它温度试验，是生物、遗传、病毒、水产、环保、医药、卫生、化验室、分析室、教育科研的必备工具。

薄膜过滤器，放式两用无菌检查薄膜滤器。该产品具有两种培养方法通用性的特点。设计合理，滤器过滤部分采用玻璃材质，化学性能稳定，密封度强，有效防止外源性污染，确保菌检成功率。

恒温培养箱又称隔水式电热细胞（霉菌）培养箱，供医疗卫生、医药工业、生物化学、工业生产及农业科学等科研部门作细菌培养、育种、发酵及其他恒温试验用。

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